新手不慌!图文详解三系诱导分化之「大鼠肌腱干细胞」,你也能学会!
大鼠肌腱干细胞作为一种独特的干细胞群体,因其在肌腱修复中的关键作用以及特有的分化潜能,成为肌腱组织工程和相关疾病治疗研究的重要细胞资源。4月24日我们开展了“大鼠肌腱干细胞‘诞生记’——从取材到鉴定全流程”云课堂,收到了很多小伙伴的催更提醒!于是我们邀请技术专家赶紧动笔编写了「肌腱干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化」实验的超细图文详解,助您掌握诱导分化实验关键要点。
- 原代细胞:OriCell®SD大鼠肌腱干细胞(货号RASTA-01001)
- 培养基:OriCell®大鼠肌腱干细胞完全培养基(货号RAXTA-90011)
- 诱导试剂盒:
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OriCell®大鼠肌腱干细胞成骨诱导分化试剂盒(货号RASTA-90021)
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OriCell®大鼠肌腱干细胞成脂诱导分化试剂盒(货号RASTA-90031)
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OriCell®大鼠肌腱干细胞成软骨诱导分化试剂盒(货号RASTA-90041)
- 细胞包被:用0.1%明胶或多聚赖氨酸溶液包被培养容器,37℃孵育30分钟,增强细胞贴附性。
- 细胞接种:取对数生长期的OriCell®SD大鼠肌腱干细胞制成单细胞悬液,以2×10⁴ cells/cm²的密度接种至包被后的培养器皿,在培养过程中,使用OriCell®大鼠肌腱干细胞完全培养基来维持细胞的生长和增殖。
- 诱导启动:当培养至70%汇合度左右开始诱导,弃原培养基换OriCell®大鼠肌腱干细胞成骨诱导分化试剂盒进行成骨诱导,每隔3天换液。(试剂盒配置方法及诱导步骤请详见产品说明书)
划重点
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细胞汇合度过高可能导致脱落,建议早期控制密度。
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诱导后期,可改为每两天半量换液以减少成骨细胞脱落、钙结节损失。
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每次换液前需将培养基预热。
诱导过程效果图
从左至右分别为:诱导3d、7d、13d、19d




- 终止诱导与清洗:吸弃成骨诱导培养基,用预冷的1×PBS轻柔清洗细胞2-3次,去除残留培养基。
- 细胞固定:每孔加入固定液,室温固定30分钟。
- 染色反应:吸弃固定液,1×PBS清洗2次后,加入茜素红工作液覆盖细胞,室温染色5-10分钟。
- 终止染色与清洗:吸弃染色液,1×PBS清洗2-3次至无浮色残留,加入1×PBS保持湿润。
- 染色结果:红色颗粒密集分布则说明矿化程度高,成骨分化成功;反之若无显色或显色少则分化失败。
茜素红染色效果-19d


划重点
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避免使用含钙的缓冲液(如含Ca²⁺的PBS),防止非特异性结合;染色后需彻底清洗,减少背景干扰。
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染色过深:缩短染色时间或降低茜素红浓度(如0.1%)。
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钙结节脱落:固定前避免剧烈晃动培养板。
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细胞状态:选用低代次且状态佳的细胞。
细胞包被:用0.1%明胶或多聚赖氨酸溶液包被培养容器,37℃孵育30分钟,增强细胞贴附性。
细胞接种:取对数生长期的OriCell®SD大鼠肌腱干细胞制成单细胞悬液,以3×10⁴ cells/cm²的密度接种至包被后的培养器皿,在培养过程中,使用OriCell®大鼠肌腱干细胞完全培养基来维持细胞的生长和增殖。
诱导启动:当培养至100%汇合度时开始诱导,弃原培养基换OriCell®大鼠肌腱干细胞成脂诱导分化试剂盒进行成骨诱导,前期按照“3天A液、1天B液”循环诱导,后期换成B液维持。(试剂盒配置方法及诱导步骤请详见产品说明书)
划重点
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诱导过程换液需要轻柔,建议沿着培养器皿侧壁轻柔滴加诱导液,防止细胞脱壁(细胞卷边)。
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当观察到有大量小脂滴出现时,停止A液诱导,换B液维持。如下图中诱导6天时后续可换成B液维持,直到脂滴看上去如石榴籽状。
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每次换液前需将培养基预热;每次换液需及时,以防细胞因营养不够导致状态不佳或死亡。
诱导过程效果图
从左至右分别为:诱导3d、6d、11d、15d



染色鉴定:油红O染色,见红色脂滴,验证成脂能力。
- 终止诱导与清洗:吸弃成脂诱导培养基,用预冷的1×PBS轻柔清洗细胞2-3次,去除残留培养基。
- 细胞固定:每孔加入固定液,室温固定30分钟。
- 染色反应:吸弃固定液,1×PBS清洗2次后,加入油红O工作液覆盖细胞,室温染色30分钟。
- 终止染色与清洗:吸弃染色液,1×PBS清洗2-3次至无浮色残留,加入1×PBS保持湿润。
- 染色结果:细胞质内出现大小不等的圆形或椭圆形红色脂滴,脂滴数量多且分布密集则分化成功;反之无红色脂滴,或仅有零星微小颗粒则分化失败。
油红O染色效果-15d
划重点
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油红O工作液的配制:按油红O贮存液:蒸馏水=3:2,混匀后250×g离心4分钟,使用上清;或者混匀后过滤使用。
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染色背景高:油红O染色后充分洗涤,或缩短染色时间。
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脂滴模糊:脂滴边界不清晰,可能因细胞过度分化(脂滴融合破裂)。
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细胞状态:选用低代次且状态佳的细胞。
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清洗染色液时需注意洗去杂质(细胞碎片或者染色液不溶物),杂质会影响染色效果。
- 细胞计数:消化离心后,去上清液,加入1mL软骨诱导基础液重悬细胞。对细胞悬液进行计数,稀释到细胞浓度约为3×105 cells/mL。
- 细胞接种:离心后,去上清,加入1mL软骨诱导基础液重悬细胞;然后150×g离心4分钟;去上清,加入1mL软骨诱导完全培养液重悬细胞;然后150×g离心4分钟。离心后不可摇动或吹打细胞团,小心地将离心管盖拧松,以便于气体交换。放入37℃,5%CO2中孵育。
- 诱导启动:每2~3天换新鲜的软骨分化诱导液,每管0.5~1mL,换液后轻弹细胞团使其能脱壁漂浮;拧松管盖,放入37℃,5%CO2中继续诱导;诱导过程中,细胞团表面会变得光滑呈胶质;持续诱导直至管内形成直径1.5~2mm软骨球,做石蜡切片。(试剂盒配置方法及诱导步骤请详见产品说明书)
诱导过程效果图-21d


- 染色鉴定:石蜡切片阿利辛蓝染色,可见染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖。
阿利辛蓝染色切片
划重点
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软骨诱导完全培养液必须现配现用。
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刚接种24h不要摇动细胞团。
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每次换液前需将培养基预热。
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