在大多数干细胞实验研究中，诱导分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞已经成为鉴定其分化潜能的金标准。

前面我们已经分享了成骨诱导分化、成脂诱导分化的操作，本期来到三系分化的最后一站——成软骨诱导分化操作讲解！

成软骨诱导分化

软骨的破坏、缺失是骨关节炎（Osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。

近年来，随着间充质干细胞（MSC）的发现和研究深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等优良特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的应用潜力。

MSC成软骨分化的过程：

MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。

体外诱导成软骨分化的鉴定

主要是形态学观察、阿利辛蓝染色，以及检测成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Western Blot检测II型胶原蛋白的表达，以及RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达等不同的角度进行鉴定；而阿利辛蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。

OriCell^® 间充质干细胞成软骨诱导分化阿利辛蓝染色效果

实操走起

所需材料

● OriCell^® 间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（套装内含基础培养基、成软骨诱导添加物、阿利辛蓝染色液）

● 4%多聚甲醛溶液或10%福尔马林溶液

实验操作步骤

1. 将3~4×10⁵个待诱导细胞转移到15mL离心管中，20℃，250×g离心4min。

2. 吸去上清。加入0.5 mL成软骨诱导分化预混液，重悬上一步离心所得沉淀，20℃，150×g 离心 5min。

3. 重复步骤2，再次清洗细胞。

4. OriCell^® 间充质干细胞成软骨诱导分化添加物II（以下简称添加物II）的添加，按照比例（1mL成软骨诱导分化预混液中加入10μL添加物II），吸取实验所需剂量的添加物II，加入相应体积的预混液中配制成成软骨诱导分化完全培养基，轻柔吹打混匀。

5. 将步骤3所得细胞沉淀用0.5mL成软骨诱导分化完全培养基重悬，20℃，150×g离心5 min。

6. 拧松离心管盖以便于气体交换。将其竖立放置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO₂培养箱中培养。

7. 当细胞团出现聚团现象时（一般为 24 h 或 48 h 后，视实际情况而定），轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。

8.自接种开始计算，每隔2~3 d给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基，每管约0.5mL。

9.持续诱导，直至管内形成直径1.5~2 mm的软骨球，即可准备切片染色。

注意事项

1、吸取添加物II之前需短暂离心试剂管，使试剂聚集于管底以便取用。

2、务必将添加物II分装保存在-20℃以下，避免反复冻融，可保存12个月。

3、加入添加物II的成软骨诱导分化完全培养基务必现配现用，4℃保存不可超过12h。

4、步骤6不需要吸去上清或重悬细胞；24h之内不要晃动离心管。

5、步骤8，每次更换培养基后，都需轻弹离心管，使软骨球脱离管底悬浮在液体中；且更换培养基后务必拧松离心管盖再放入培养箱中。

软骨球切片染色操作步骤

注意：本步骤以石蜡切片染色为例。若使用冰冻切片，请遵照切片机使用规程。

1. 固定。诱导形成的软骨球用1×PBS清洗后，浸泡于4%多聚甲醛溶液（或10%福尔马林溶液），固定30min以上。注意：固定液需现配现用。

2. 脱水。固定好的软骨球使用梯度浓度酒精脱水，方式如下，每一阶段30 min。

50%酒精→70%酒精→80%酒精→95%酒精→无水酒精

注意：

1）脱水必须在有盖的容器中进行，防止吸收空气中的水分；

2）软骨球不要在酒精中浸泡太久，易碎裂；

3）在更换酒精时，可吸出低浓度酒精，再加入高浓度酒精。避免移动增加软骨球碎裂的风险。

3. 透明。因酒精和石蜡不相溶，所以脱水后需经二甲苯过渡。方式如下：

• 二甲苯和无水酒精按体积比 1:1 混匀。将软骨球浸泡其中 2 h。
• 将软骨球浸泡在纯二甲苯中 1.5 h。
• 更换新的二甲苯，继续浸泡 1 h。

注意：

1）透明必须在有盖的容器中进行，防止吸收空气中的水分；

2）透明过程中，如果软骨球周围出现白色雾状气泡，说明其中水未被脱净。应重新放回酒精中脱水再透明。

4. 浸蜡。为了除去软骨球中的透明剂，使石蜡渗透到内部以便包埋，需要浸蜡处理。

• 二甲苯和石蜡按体积比 1:1 混匀。将软骨球浸泡其中，再一起放置于 40℃烘箱中 40 min。
• 将软骨球浸泡在纯石蜡中，放置于 55℃烘箱中 30 min。

注意：

1）浸蜡尽量保持在较低温度中进行，石蜡不凝固即可；

2）温度要恒定，不可忽高忽低。

5. 包埋。将软骨球取出，置于模具中。倒入石蜡，静置冷却。待石蜡充分冷却成形，取出，修整蜡块。

6. 切片。连续切片，每片厚度 3 μm。

7. 粘片。将软骨球切片用粘贴剂粘附于载玻片上，在 35℃烘箱中烘干。

8. 脱腊。

• 纯二甲苯浸泡切片 15 min，更换新的二甲苯浸泡切片 10 min。
• 二甲苯和无水酒精按体积比 1:1 混匀。浸泡切片 10 min。
• 依次使用 95%、85%、70%、50%酒精浸泡切片 10 min，晾干。

9. 染色。

• 在晾干的切片上滴加阿利辛蓝，37℃染色 1 h。
• 用自来水冲洗载玻片 5 min，晾干。

10. 显微镜下观察阿利辛蓝染色效果。阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖。

新葡萄新京威尼斯游戏OriCell^®干细胞诱导分化

依赖于成熟的干细胞技术平台，我们可以为您开展多种干细胞分化潜能研究的实验服务。其中针对特定种属优化定制的诱导分化试剂盒，可向成骨、成脂、成软骨、成肝等多个方向诱导，性能稳定，诱导分化效果好！同时，我们可以按照您提供的诱导试剂和诱导方法为您完成特定的干细胞诱导实验，也可以按照您的目的和要求，在各种干细胞诱导途径中为您探索出一套相对完善的方法。